多拉菌素为20世纪90年代研制开发的新一代大环内酯类抗寄生虫药，其生物合成途径是以环己烷羧酸为前体，经多步生物合成，形成多拉菌素。其产生菌为基因工程菌，是产阿维菌素的阿维链霉菌经基因重组后，而得到主产多拉菌素的基因工程菌。多拉菌素是一种阿维菌素类抗生素，是阿维菌素的第三代衍生物。与其他大环内酯类抗生素不同，其生物学活性主要表现为高效驱杀动物体内外寄生虫。经过近20年的研究，它被认为是目前阿维菌素族中优秀的抗寄生虫药物之一，因其具有驱虫范围广、半衰期长、作用效果好、体内残留低和无不良反应等优点，是目前具有开发潜力的兽用抗寄生虫药物之一。

多拉菌素属脂溶性药物，可溶于许多有机溶剂如二甲基甲酰胺、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙二醇和二甲基亚砜等，但在水中的溶解度极低，仅为0.0006～0.0009mg/L，相对分子质量为899.11。由于多拉菌素属于胞内产物，存在于菌体内，且发酵液中组分十分复杂，多拉菌素的浓度很低，需通过各种分离提取技术来实现目标产物的富集。目前，国内一方面由于有专利的限制，生产多拉菌素的厂家较少，对于多拉菌素的需求主要依赖于进口；另一方面，对多拉菌素的工业化生产起步较晚，分离纯化工艺等还缺乏系统性的研究。本文主要研究了陶瓷膜法提取多拉菌素工艺，优化了工艺过程中的操作参数，旨在阐述陶瓷膜提取技术比传统提取技术的优势，从而实现陶瓷膜技术在多拉菌素提取中的工业化应用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料性质和前处理

多拉菌素发酵液由浙江海正药业股份有限公司提供，呈灰色的浑浊状，湿固含量40%～42%，黏度700mPa·s，pH7～8，发酵液温度37℃。

1.1.2 化学试剂

HPLC用的甲醇和乙腈均为色谱纯，购自Fisher公司；提取用的甲醇为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；多拉菌素标准品购自Sigma公司。

1.2 陶瓷膜设备

陶瓷膜元件：陶瓷膜材质为氧化铝、氧化锆或氧化钛，通道数为19，长度1200mm，平均孔径为50nm。膜组件：单支膜组件，面积0.42㎡。陶瓷膜设备为防爆型。其中泵参数：流量Q=5.8m³/h，扬程H=56.5m，功率P=1.1kW。

1.3 方法

1.3.1 试验方法

（1）传统提取法：将50mL多拉菌素发酵液先经3500r/min离心10min，弃滤液，收集固体物（菌体）。菌体用甲醇浸泡，于室温下，震荡提取12h，再经离心，去除大分子等沉淀物，收集离心液，即得到多拉菌素甲醇提取液。并应用高效液相色谱分别检测发酵液和甲醇提取液中的多拉菌素含量。

往菌体中分别添加1、1.5、2、2.5、3、3.5和4BV（BV表示倍数，质量比，相对于发酵液，以下皆同）甲醇溶液提取1次，考察不同甲醇添加倍数对多拉菌素收率的影响；在较优甲醇添加倍数的前提下，对收集的菌体分别提取1次、2次和3次，考察不同甲醇提取次数对多拉菌素收率的影响。

（2）陶瓷膜提取法：将40kg多拉菌素发酵液置于陶瓷膜设备中，采用错流过滤方式，设定操作压力2.3bar，膜面流速4m/s，温度30～45℃，将发酵液浓缩至2.67倍，弃去陶瓷膜渗透液，获得循环罐中的菌体；然后开始加1.5BV纯水连续洗滤菌体；待结束后再用3BV甲醇溶液连续提取菌体中的多拉菌素，收集陶瓷膜渗透液，即为多拉菌素甲醇提取液。并应用高效液和色谱分别检测发酵液和甲醇提取液中的多拉菌素含量。

（3）陶瓷膜操作参数的优化：

①膜面流速的优化：取40kg多拉菌素发酵液置于陶瓷膜设备中，提高膜面流速至5m/s，控制操作压力2.3bar，温度23～44℃，陶瓷膜浓缩2.67倍，加1.5BV纯水连续洗滤菌体，加3BV甲醇连续提取多拉菌素，考察膜面流速对陶瓷膜过滤通量的影响。

②操作压力的优化：取40kg多拉菌素发酵液置于陶瓷膜设备中，设定浓缩阶段操作压力1.3bar，加1.5BV纯水连续洗滤阶段操作压力1.8bar，加3BV甲醇连续提取阶段操作压力2.4bar，膜面流速5m/s，温度27～45℃，陶瓷膜浓缩2.67倍，按照以上方法提取多拉菌素，考察阶段性提高操作压力对陶瓷膜过滤通量的影响。

1.3.2 分析方法

（1）有效成分的测定：采用高效液相色谱法。

（2）膜表征方法：陶瓷膜水通量测定：设备稳定运行10min后，直至水通量基本稳定，测定条件为1bar、常温下测量水通量。可直接读取浮子流量计刻度或通过以下公式计算：

J=Z/(S×t)

式中：J为水通量，单位L/(h·㎡)；Z为t时间内渗透水的体积，单位L；S为膜面积，单位㎡；t为测量的时间，单位h。

料液通量测定：测定膜过滤过程中某一时间段的通量情况，即计算出单位时间、单位膜面积渗透液的通量值。

膜过滤通量测定：记录膜过滤的耗时（即从进料开始至停止出料所用时间），测定系统渗透液的总质量，并计算出单位时间、单位膜面积滤液的通量值。

多拉菌素的收率：物料提取后多拉菌素质量与发酵液中多拉菌素质量的百分比。

2 结果与讨论

2.1 传统工艺提取多拉菌素

邹泽先等考察了甲醇、乙醇、乙腈、丙酮及异丙醇等提取试剂对多拉菌素提取的效果差异，结果表明以乙腈及甲醇的提取效果较好，且两者差异不显著，但甲醇的成本及毒性均较乙腈低，故提取试剂选择甲醇。往菌体中分别添加1、1.5、2、2.5、3、3.5和4BV甲醇溶液提取1次，随着甲醇添加倍数的提高，多拉菌素的提取收率越高。当添加倍数为3BV时，收率提高幅度有所下降，且溶剂添加的越多，也增加了甲醇购买和后续回收的成本，因此选择甲醇添加倍数为3BV，其收率可达92.1%。

按照甲醇添加倍数为3BV，提取1次、2次和3次多拉菌素收率分别为92.3%、96.3%和97.3%。结果表明，随着提取次数的增加，收率呈现逐渐提高的趋势，提取3次时收率仅提高了0.8%，故选择对发酵液进行甲醇提取2次。

2.2 陶瓷膜法提取多拉菌素

多拉菌素为胞内代谢产物，不溶于水，可溶于大部分有机溶剂。传统工艺一般通过离心收集和洗涤菌体，再将菌体通过有机溶剂溶出或机械破碎的方式提取其中有效成分，目前普遍采用较为安全有机溶剂甲醇来提取。此法主要存在人工操作复杂、处理时间长、收率低等缺点，因此，下文主要研究了陶瓷膜法提取多拉菌素发酵液，考察陶瓷膜技术对多拉菌素提取的影响，并优化操作参数，如操作压力和膜面流速等。

2.2.1 陶瓷膜提取技术的实验结果

由于物料固含量较高，随着浓缩倍数的提高，通量急剧下降，陶瓷膜浓缩2.67倍，瞬时通量仅为25L/(㎡·h)。起始加甲醇使得整体浓度下降，通量明显升高，但随着提取时间的延长，胞内的部分大分子物质也被溶出，且逐渐污染陶瓷膜，使得膜通量也呈现缓慢下降的趋势。设备运行130和270min时的通量存在振荡，主要是由于加水洗滤和加甲醇提取每次1L，视为连续，在这期间通量也存在起始较高，然后随着浓度升高，通量逐渐下降的趋势，主要是存在检测时间偏差的问题。本次试验共出陶瓷膜渗透液205kg，耗时360min，膜过滤通量可达81.3kg/(㎡·h)。陶瓷膜渗透液澄清透明，无菌体或细胞碎片透出，收率可达97.6%，其结果均优于传统除杂提取工艺。因此，陶瓷膜技术可实现多拉菌素的连续提取。

2.2.2 陶瓷膜膜面流速的优化

膜面流速的提高有利于增大料液与膜之间的剪切力，从而减缓膜污染的速度。本次试验提高膜面流速至5m/s。提高膜面错流流速可提高料液通量，主要表现在整体瞬时通量提高，且通量下降幅度减小。共出陶瓷膜渗透液205kg，耗时290min，膜过滤通量可达100.9kg/(㎡·h)，比膜面流速4m/s提高了24.1%，收率可达97.2%。因此，可将膜面流速提至5m/s。

2.2.3 陶瓷膜操作压力的优化

由于多拉菌素发酵液固含量较高，对膜的污染较为严重，通量也随之大幅度下降，且操作压力与膜污染的程度呈正相关，故本次实验采用阶段性提高操作压力的方式来缓解膜污染的速度。从发酵液中陶瓷膜法提取多拉菌素分为浓缩阶段、洗滤阶段和提取阶段，相对前2批实验，3个阶段的通量降幅越来越小，越来越稳定，表明膜污染得以减缓。共出陶瓷膜渗透液205kg，耗时245min，膜过滤通量可达119.5kg/(㎡·h)，比在膜面流速4m/s和操作压力2.3bar时的通量提高了47.0%，收率可达97.5%。因此，采用阶段性提高操作压力有利于提高陶瓷膜过滤通量。

2.3 传统工艺和陶瓷膜工艺的比较

根据“2.1”和“2.2”项的试验结果，分别设计出多拉菌素发酵液处理能力为2t/h的传统工艺和陶瓷膜工艺，并从设备运行成本、工艺设计和人工等进行比较。

以发酵液处理能力为2t/h（16t/d，300d/年）的传统工艺和陶瓷膜工艺进行比较。传统工艺需要配置5t/h处理量的国产离心机收集和洗涤菌体，处理时间8h；120m³的罐子进行甲醇搅拌提取，处理时间12h；还需20t/h处理量的进口离心机，用于提纯多拉菌素，处理时间5h，再加上准备时间，总共耗时24h。而陶瓷膜工艺则需要配置4个91芯的组件，膜面积共152㎡即可实现生产需求，处理时间10h（包括清洗时间2h）。传统工艺3个工段3班倒共需要12个人，而陶瓷膜工艺仅1班即可实现连续生产。且相对于传统工艺，陶瓷膜工艺可减少一半甲醇提取用量，即每年可减少14400t的甲醇用量，收率还高出1.2%。传统工艺的设备折旧费（折旧按10年计算，包括每年的耗材费）和人工成本使得整个运行成本超过陶瓷膜工艺（陶瓷膜折旧5年，膜设备折旧10年），每吨物料处理费用增加4.1元以上（不包括溶剂成本和收率折算后的利润）。

2.4 陶瓷膜清洗方法

多拉菌素发酵液中含有较多的菌体、蛋白质以及培养基残留成分等，陶瓷膜过滤会产生膜表面污染，甚至是膜孔内污染，影响陶瓷膜的下一次过滤性能。因此，必须对膜进行周期性的清洗。常规陶瓷膜的清洗可先用水冲刷，去除膜表明的可逆污染，由于陶瓷膜耐酸、耐碱、耐氧化剂的特性，再结合化学试剂和循环清洗对污染物进行分解、置换作用，通过错流所形成的剪切力去除不可逆污染。

通过多次实验考察，清洗方法如下：配置质量分数为1%～2%（以循环水质量计，下同）的NaOH和0.5%～1%的NaClO溶液进行循环清洗1h，再用清水冲洗至中性，陶瓷膜的水通量即可达到初始的99%，甚至更佳。

3 结论

3.1 传统工艺和陶瓷膜工艺的优化

优化后的多拉菌素传统工艺的收率达96.3%，甲醇提取次数2次，每次添加用量为3BV（质量比，相对于发酵液，以下皆同）。优化后的陶瓷膜工艺的收率达97.5%，膜面流速5m/s，温度小于45℃，采用阶段性提高操作压力的方法，连续纯水洗滤1.5BV，连续甲醇提取3BV，膜过滤通量可达119.5kg/(㎡·h)，比优化前提高了47.0%。

3.2 传统工艺和陶瓷膜工艺的对比

比较了处理能力2t/h的传统工艺与陶瓷膜工艺，陶瓷膜法操作时间缩减2倍，人工减少5倍，甲醇用量减少1倍，且收率仍然高出1.2%，每吨物料处理费用减少4.1元以上。

3.3 陶瓷膜的再生

采用质量分数为1%～2%的NaOH与0.5%～1%的NaClO混合清洗的方法，清洗后陶瓷膜的水通量重复恢复率可达99%以上，再生性较好。