牡蛎，又名蚝，是沿海常见的一种珍贵贝类，它滋味鲜美，营养丰富，不仅含有大量的蛋白质、维生素、牛磺酸等营养成分，还有丰富的糖原，具有很好的抗氧化抗衰老功效，有“海底牛奶”的美称。随着人们对牡蛎的成分、保健功能的进一步了解，近年来对牡蛎的研究也越来越多，主要集中在对生鲜牡蛎肉的酶解方面，用于制备风味基料和具有保健功能的牡蛎口服液，而对于牡蛎酶解液的分离方式和方法报道较少，由于牡蛎酶解液含有较多的杂质，如：贝壳、沙子以及未分解的蛋白和其他成分，如果不进行分离，会严重影响酶解液的应用效果。本研究结合中试的实验设备，探讨了牡蛎酶解液的分离方法，为牡蛎的工业化应用提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

牡蛎  购于市场；一水柠檬酸、食盐  市售；碱性蛋白酶（酶活2.4U/g）、风味蛋白酶（500LAPU/g）  诺维信生物技术有限公司。

碟式分离机  Alfalaval；pHS-3C型精密pH计  上海雷磁仪器厂；多管架台式离心机  湖南湘仪离心设备厂；电热恒温水浴锅  上海一恒科技有限公司；酶解罐  上海天宇机械有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 分析方法

水分含量测定：直接干燥法（参照GB/T5009.3-2011）；

灰分含量测定：灼烧法（参照GB/T5009.4-2010）；

粗蛋白含量测定：凯氏定氮法（参照GB/T5009.5-2010）；

氨基态氮：甲醛滴定法（参照GB/T5009.39-2003）；

挥发性盐基态氮：半微量凯氏定氮法（参照GB/T5009.44-2003）；

粗脂肪含量测定：索氏抽提法（参照GB/T5009.6-2003）。

1.2.2 酶解液的制备

将牡蛎添加1:1的水，用胶体磨磨细，调节pH至6.5～7.0，加入总量0.05%的碱性蛋白酶和0.05%的风味蛋白酶，搅拌均匀，在55～60℃酶解12h，检测指标合格后，加热至85℃灭酶20min，储存备用。

1.2.3 沉降速度的测定

取被测样品，加入100mL量筒内，定量至100mL，静置，使悬浮液中的固体颗粒自然沉降，待静置2h后，以上层清液和下层渣的分界线为基准，检测上层清液的高度和渣的高度，沉降速度（cm/h）=清液可视容积/总容积/2=清液可视高度/溶液总高度/2。

1.2.4 碟式分离机离心

按照确定的加热絮凝方式对酶解液进行前处理，采用碟式分离机对酶解液进行离心，过程中调整分离机的流量、背压和排渣时间。

1.2.5 离心效果的验证

取20g酶解液加热到85℃，然后静置保温15min，把酶解液轻轻倾入离心管中，定量离心管中的酶解液为10g，将处理好的样品放到多管架台式离心机上离心，离心机转速设定为4000r/min，离心时间5min，离心完毕后小心倾出上层清液，测定下层渣的重量，渣含量（%）=渣的重量/酶解液总重量。

2 结果与讨论

将牡蛎酶解液在85℃加热15min，轻轻倾入离心管中，放入多管架台式离心机上离心，离心机转速设定为4000r/min，离心时间5min，离心后轻轻倒出上层清液，取下层沉淀进行指标分析，如下表：

通过指标的分析可以发现，沉淀主要为粗蛋白、脂肪以及灰分，酶解过程中一些未分解完全的蛋白，在加热过程中变性絮凝成大分子物质，在密度差的影响下，逐步沉淀到下层，脂肪本身的密度虽然相对低，但其与蛋白质结合起来形成大分子，也沉淀到酶解液的下层。由沉淀的现象可以分析出，酶解液中的大分子物质与清液之间存在一定的密度差，从原来来看，是可以通过离心的方式来去除沉淀的。

工业化生产酶解液，要求分离效果好，效率高，至少达到10m³/h以上，且能够连续操作。结合杂质的沉降特性以及设备特性，本实验选择碟式分离机进行分离，碟式分离机的分离因数较高，可达3000～10000，碟片数较多，增大了沉降面积，碟片间的相互空隙小，缩短了沉降距离，因此分离效果较好，且结构简单、分离成本低。本实验用碟式分离机对加热后的酶解液直接进行分离，分离效果较差，沉淀难以离心出，主要因为沉淀与清液间的密度差太小，因此需要对酶解液进行絮凝前处理，加大两相之间的密度差。

2.1 酶解液的絮凝效果研究

酶解液的絮凝效果受加热温度、加热时间、降温时间、降温速度、pH以及絮凝剂种类的影响，本实验探讨了各种影响因素对牡蛎酶解液絮凝效果的影响。

2.1.1 加热温度和加热时间对杂质的絮凝效果

牡蛎酶解液在各种温度下的絮凝效果都较差，加热到80～85℃也仅有少量的絮凝，将以上样品放置常温24h，未出现分层，说明单纯通过加热的方式来对酶解液进行絮凝，未能完全破坏胶体周围的水合系统，胶体粒子之间的静电引力不够，发生凝聚的速度很慢，难以达到分离的效果。

2.1.2 pH对酶解液絮凝效果的影响

当溶液的pH处在蛋白质的等电点时，蛋白质分子的静电荷为零，分子相互间的疏水作用较强，蛋白质分子相互吸引形成更大的分子聚集体，形成沉淀，本研究通过一水柠檬酸来调整酶解液的pH，在85℃加热，常温下沉淀，比较不同pH条件下的蛋白质絮凝效果。

注：表中沉降速度是以样品加热保温30min后进行测定，“+”越多表示絮凝的沉淀越多。

从絮凝的现象来看，pH在4.5～5.0之间，酶解液中蛋白质的絮凝效果较好，当达到6.0时就无絮凝产生，因此可确定牡蛎酶解液中蛋白的等电点约在4.5～5.0之间，通过调整pH至蛋白的等电点可以起到较好的絮凝效果，且絮凝时间短，在15～20min即可以达到较好的效果。絮凝之后不适宜长时间加热，继续加热会导致分子运动加剧，使结合的聚集体重新分散开，不利于后续的分离。

2.1.3 絮凝剂对酶解液絮凝效果的影响

絮凝剂是借助无机或有机的离子或分子，在胶体粒子间起到架桥作用，从而使固体粒子团聚成较大颗粒，本实验采用几种絮凝剂对酶解液进行处理。

从几种絮凝剂的絮凝和沉降效果来看，氯化钙的效果较好，但跟直接调节pH至等电点的效果相差不大，因此确定采用调节酶解液的pH至4.5～5.0，加热至85℃保温15min，自然降温进行絮凝。

2.2 离心分离的优化

2.2.1 分离机参数的确定

在酶解液充分絮凝的前提下，采用两相离心的方式对酶解液进行离心，固定碟式分离机的转速为9360r/min（碟式分离机具有操作面板，有电子显示其转速），排渣时间为20min，调节背压保证流量稳定，比较不同流量下清液的澄清效果。

从离心效果来看，离心的流量低，则离心后清液中渣的含量会相应减少，当离心流量从150～200L/h时，渣的含量变化不大，综合设备的稳定运行要求，确定采用200L/h；离心前渣含量为4.85%，离心后渣含量为0.68%，离心去除了约86%的渣，基本可以达到酶解液应用的品质要求。

2.2.2 温度对离心效果的影响

实验固定离心的流量为200L/h，分离机的转速为9360r/min，排渣时间为20min，比较不同温度下清液的澄清效果。

结果表明，当酶解液的温度为60℃时，离心后清液渣的含量较低，温度高离心的效果反而不好，原因可能是离心的温度高，分子运动剧烈，两相之间的密度差减小，因此可将酶解液进行絮凝冷却到60℃保温进行离心处理。

2.2.3 离心前后酶解液指标的变化

离心后的氨基态氮较离心前降低0.01%，全氮降低0.15%，挥发性盐基氮降低25%左右，说明渣中所含的挥发性盐基氮含量较高，离心去渣可有效改善牡蛎酶解液的风味。

全氮指标计算：

渣降低4.85%-0.68%=4.17%

渣中的干物质含量为34.8%，则渣中的全氮为：4.17%×34.8%×64.4%/6.25=0.15%

因而损耗的全氮为0.15%

2.3 均匀设计法确定各分离参数的影响

实验采用U₆（6⁴）等水平均匀设计表对加热温度、加热时间、加热pH，以及离心的转速进行详细的考察，实验结果采用回归分析法，确定各参数的影响。

对以上的实验结果进行回归分析，对回归方程进行方差分析。由方差分析可知，所求得的回归方程非常显著。

通过计算，四个标准化偏回归系数分别为b1’=1.005×10^-4，b2’=0.6630，b3’=6.1447，b4’=6.7632，可见因素主次顺序为：离心流量＞加热pH＞絮凝时间＞温度。

3 结论

本研究对牡蛎酶解液的沉淀成分进行了分析，确定主要成分为蛋白和脂肪，确定采用调等电点加热絮凝的方式对酶解液进行前处理，通过调节pH至4.5～5.0，加热至85℃保持15min，后降温至60℃，采用碟式分离机进行离心，当分离机转速为9360r/min，流量为200L/h，排渣时间为15min时，可去除86%以上的杂质，离心前后氨基态氮变化不大，且可以减少25%左右的挥发性盐基氮，离心去渣可有效提高牡蛎酶解液的风味，达到了后工序对酶解液的品质要求。通过等水平均匀设计实验确定了各因素对离心效果的影响大小为：离心流量＞加热pH＞絮凝时间＞絮凝温度。